Количествената PCR с флуоресценция в реално време е метод за измерване на общото количество продукт след всеки цикъл на полимеразна верижна реакция (PCR) в реакция на амплификация на ДНК с помощта на флуорофор.Методът се използва за количествено определяне на специфични ДНК последователности в пробата, която трябва да бъде тествана чрез вътрешни или външни референтни методи.От самото начало флуоресцентните количествени PCR анализи стават все по-популярни сред преподавателите по лаборатории.
Принцип на флуоресцентна PCR: Флуоресцентна PCR, първоначално наречена TaqManPCR, а по-късно също и Real-TimePCR, е нова техника за количествено определяне на нуклеинова киселина, разработена от PE (PerkinElmer) в САЩ през 1995 г. Техниката се основава на добавянето на флуоресцентно белязана проба или съответна флуоресцентно багрило към конвенционален PCR, за да се постигне неговата количествена функция.Принципът: докато PCR реакцията протича, продуктите на PCR реакцията се натрупват и интензитетът на флуоресцентния сигнал се увеличава в еднаква степен.С всеки цикъл се събира сигнал за интензитет на флуоресценция, така че да можем да наблюдаваме промяната в количеството на продукта чрез промяната в интензитета на флуоресценцията и по този начин да получим графика на кривата на усилване на флуоресценцията.
Като цяло кривата на усилване на флуоресценцията може да бъде разделена на три фази: фаза на флуоресцентен фонов сигнал, фаза на експоненциално усилване на флуоресцентния сигнал и фаза на плато.По време на фазата на фоновия сигнал, усиленият флуоресцентен сигнал е маскиран от флуоресцентния фонов сигнал и промените в количеството на продукта не могат да бъдат определени.Във фазата на платото продуктът на амплификация вече не се увеличава експоненциално, няма линейна връзка между количеството на крайния продукт и количеството на началния шаблон и броят на началните копия на ДНК не може да бъде изчислен въз основа на крайното количество на PCR продукта.Само във фазата на експоненциално усилване на флуоресцентния сигнал има линейна зависимост между логаритъма на количеството на PCR продукта и количеството на началния шаблон и можем да изберем да го определим количествено на този етап.За удобство на количественото определяне и сравнение, две много важни концепции са въведени в техниката на флуоресцентна количествена PCR в реално време: прагът на флуоресценция и стойността на CT.
Прагът е изкуствено зададена стойност на кривата на усилване на флуоресценцията.експоненциална фаза на PCR амплификация.
Стойност на Ct: е броят на циклите, през които е преминал флуоресцентният сигнал във всяка реакционна епруветка, за да достигне зададената стойност на домейна.
Връзката между стойността на Ct и началния шаблон: проучванията показват, че стойността на Ct на всеки шаблон има линейна връзка с логаритъма от номера на началното копие на този шаблон, колкото повече копия е броят на началното копие, толкова по-малък е Ct стойност.Стойностите на Ct са относително стабилни.Стандартна крива може да бъде направена с помощта на стандарт с известен начален номер на копие, където хоризонталната координата представлява логаритъма на началния номер на копието, а вертикалната координата представлява стойността на Ct, както е показано на фигурата по-долу.
Следователно, чрез получаване на стойността на Ct на неизвестна проба, началният брой на копията на тази проба може да бъде изчислен от стандартната крива.
Стойността на Ct не е постоянна и може да бъде повлияна от различни проби и различни инструменти, дори ако една и съща проба се повтори 2 пъти на един и същ инструмент, стойността на Ct може да варира.
Количествени флуоресцентни анализи: Количествените флуоресцентни анализи могат да бъдат разделени на флуоресцентни сонди и флуоресцентни багрила в зависимост от използваните маркери.Флуоресцентните сонди включват технология Beacon (технология за молекулярни маяци, представена от American Tagyi), сонди TaqMan (представена от ABI) и технология FRET (представена от Roche);флуоресцентните багрила включват наситени флуоресцентни багрила и ненаситени флуоресцентни багрила, типичният представител на ненаситените флуоресцентни багрила е SYBRGreen I, който се използва често;наситени Типичният представител на ненаситените флуоресцентни багрила е SYBRGreenⅠ;наситените флуоресцентни багрила са EvaGreen, LCGreen и др.
SYBRGreenI е често използвано ДНК свързващо багрило за флуоресцентна PCR, което се свързва неспецифично с двойноверижна ДНК.В свободното си състояние SYBRGreenI излъчва слаба флуоресценция, но след като се свърже с двойноверижна ДНК, неговата флуоресценция се увеличава 1000 пъти.Следователно общият флуоресцентен сигнал, излъчван от реакцията, е пропорционален на количеството налична двойноверижна ДНК и се увеличава с увеличаване на продукта на амплификация.
Предимства на двуверижни ДНК свързващи багрила: прост експериментален дизайн, необходими са само 2 праймера, няма нужда да се проектират сонди, няма нужда да се проектират множество сонди за бързо тестване на множество гени, възможност за извършване на анализ на кривата на топене, тестване на специфичността на реакция на усилване, ниска първоначална цена, добра обобщеност и следователно по-често използвани в изследванията у нас и в чужбина.
Метод на флуоресцентна сонда (техника на Taqman): Когато се извършва PCR амплификация, се добавя двойка праймери заедно със специфична флуоресцентна сонда.Когато сондата е непокътната, флуоресцентният сигнал, излъчван от репортерната група, се абсорбира от потушената група и не се открива от PCR инструмента;по време на PCR амплификация (във фазата на удължаване), активността на 5'-3' разцепване на Taq ензима разгражда сондата ензимно, което прави репортерната флуоресцентна група и потушената флуоресцентна група
Приложения на флуоресцентна количествена PCR.
Изследвания по молекулярна биология:
1. Количествен анализ на нуклеинова киселина.Количествен и качествен анализ на инфекциозни заболявания, откриване на патогенни микроорганизми или вируси, като скорошната епидемия от грип A (H1N1), откриване на броя на генни копия на трансгенни растения и животни, откриване на нива на инактивиране на RNAi ген и др.
2. Анализ на диференциална генна експресия.Сравнение на разликите в генната експресия между третираните проби (напр. лечение с лекарства, физическо третиране, химическо третиране и т.н.), разликите в експресията на специфични гени в различни фази и потвърждение на cDNA microarray или резултати от диференциална експресия
3. Откриване на SNP.Откриването на единични нуклеотидни полиморфизми е важно за изследването на индивидуалната чувствителност към различни заболявания или индивидуалния отговор към специфични лекарства и поради гениалната структура на молекулярните маяци, след като информацията за последователността на SNP е известна, е лесно и точно да се използвайте тази техника за откриване на SNP с висока производителност.
4. Откриване на метилиране.Метилирането е свързано с много човешки заболявания, особено рак, и Laird съобщава за техника, наречена Methyllight, която третира ДНК преди амплификация, така че неметилираният цитозин да стане урацил и метилираният цитозин да не се повлиява, използвайки специфични праймери и сонди на Taqman за разграничаване между метилирана и неметилирана ДНК .по-чувствителен.
Медицински изследвания:
1. Пренатална диагностика: хората не могат да лекуват наследствени заболявания, причинени от променен генетичен материал, и засега те могат само да намалят броя на родените болни бебета чрез пренатален мониторинг, за да предотвратят появата на различни наследствени заболявания.Това е неинвазивен метод, който лесно се приема от бременни жени.
2. Откриване на патогени: Флуоресцентният количествен PCR анализ позволява количествено определяне на патогени като gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, човешки папилома вирус, херпес симплекс вирус, човешки имунодефицитен вирус, вирус на хепатит, грипен вирус, Mycobacterium tuberculosis, EBV и цитомегаловирус.Той има предимствата на висока чувствителност, малък размер на извадката, бързина и простота в сравнение с традиционните методи за тестване.
3. Оценка на ефикасността на лекарствата: количественият анализ на вируса на хепатит B (HBV) и вируса на хепатит C (HCV) показва, че връзката между вирусния товар и ефикасността на някои лекарства.Ако серумното ниво на HBV-DNA намалее по време на лечението с ламивудин и след това се повиши отново или надвиши предишното ниво, това е показателно за вирусна мутация.
4. Онкогенетично изследване: Въпреки че механизмът на развитие на тумора все още не е ясен, широко се приема, че мутациите в съответните гени са основната причина за онкогенната трансформация.Повишена експресия и мутация на онкогени може да се наблюдава в ранните стадии на много тумори.Количественият PCR с флуоресценция в реално време е ефективен не само при откриване на мутации в гени, но също така може точно да открие експресията на онкогени.Този метод е използван за откриване на експресията на различни гени, включително гена на теломераза hTERT, гена WT1 на хроничната гранулоцитна левкемия, онкогенния ER ген, PSM гена на рака на простатата и свързаните с тумор вирусни гени.
Преведено с www.DeepL.com/Translator (безплатна версия)
Време на публикуване: 21 юни 2022 г