1. Ако получа епруветка със замразени клетки, мога ли да я поставя директно в течен азот за съхранение?
В много случаи клетките, транспортирани върху сух лед (-80°C), могат да бъдат поставени обратно в течен азот и след това бързо размразени.Въпреки това, клетъчната жизнеспособност може да бъде намалена след такова третиране.За някои чувствителни клетъчни линии това може да затрудни възстановяването на клетките.Смята се, че това явление се дължи на промяна в структурата на ледените кристали в клетките в резултат на промяната на температурата.Поради това се препоръчва клетките да бъдат размразени и култивирани възможно най-скоро след получаването им.Намалете времето за съхранение при -80°C.Тази температура се използва само за транспорт.
2. Какви мерки за безопасност трябва да се вземат при отстраняване на клетки от течен азот за възстановяване?
Клетъчните криоепруветки в течен азот, които не са напълно запечатани и в тях изтича течен азот, могат да причинят експлозия, ако температурата на криотубата се повиши рязко при размразяване.Поради това се препоръчва да се носят очила и защитни ръкавици, когато се отстраняват клетки от течен азот.За реанимация епруветката за замразяване трябва да се разклаща непрекъснато във водна баня с температура 37°C, за да се размрази напълно замразяващият разтвор в рамките на 1-2 минути.След това избършете външната страна на епруветката с тампон, напоен със спирт, след това я поставете в ултрачистата маса и прехвърлете клетките в центрофужна епруветка с добавени 10 ml културална среда, центрофугирайте при 1000 rpm за 5-10 минути, изхвърлете супернатанта, добавете подходящото количество културална среда и инокулирайте културалната колба и инкубирайте в 5% CO2 инкубатор.
3. Защо клетките трябва да се съхраняват в парната фаза на резервоар с течен азот, а не в течната фаза?
Клетките, съхранявани в газовата фаза на течния азот, са по-склонни да бъдат съживени.Докато в течната фаза на течния азот, ако епруветките за лиофилизация не са правилно запечатани или имат течове, директният контакт между клетките и течния азот може да компрометира жизнеспособността на клетките след размразяване.
4. За суспензионни клетки, как да сменя хранителната среда?
Култивирането на суспензионни клетки може да се извърши чрез просто добавяне на свежа среда (ако пространството позволява) или чрез отделяне на клетките от старата среда чрез центрофугиране (100 xg за 5 минути) и последващо ресуспендиране на утаените клетки в прясна среда.Въпреки това, за повечето суспензионни клетъчни линии простото добавяне на среда е по-добър метод.Така или иначе, средата трябва да се поднови, преди клетките да достигнат най-голямата си плътност на насищане.Плътността на насищане на клетките варира между 3 x 10 5 и 2 x 10 6 в зависимост от клетъчната линия и условията на култивиране (почивка или разбъркване, нива на кислород и т.н.).Клетките трябва да бъдат разредени до по-ниска клетъчна концентрация, за да се позволи достатъчно възстановяване на хранителните вещества, за да се запази логаритмичният растеж на клетките.Ако средата просто се смени, без да се намали клетъчната плътност, клетките бързо ще изчерпят средата и ще умрат.Ако клетките са разредени под най-малката си плътност, те ще навлязат в лаг фаза и ще растат много бавно или ще умрат.Всяка суспензионна клетъчна линия има различна плътност на насищане и интервал на преминаване, така че дневният брой клетки е начинът за наблюдение на суспензионните клетъчни линии*.
5. Какво е препоръчителното ниво на CO2 за клетъчна култура?
Въпреки че нивата на CO2 в системите за клетъчни култури варират от 0,03% до 40% (обикновено около 0,03% CO2 в атмосферата), много често е да няма добавяне на CO2 към въздуха или концентрация на CO2 от 5% до 10%.Важно е концентрацията на натриев бикарбонат в средата да се балансира с нивото на CO2 в газовата фаза.Клетките произвеждат CO2 и изискват малко количество въглена киселина за растеж и оцеляване.Ако не се добавя CO2 и клетките се размножават, може да се използва 4 mM (0,34 g/L) безводен натриев бикарбонат.В този момент обаче капакът на културалната колба трябва да се затегне.Ако системата за култивиране изисква 5% или 10% CO2, използвайте съответно 23,5 mM (1,97 g/L) или 47 mM (3,95 g/L) натриев бикарбонат при 37°C с начално pH приблизително 7,6.При тези условия колбата трябва да се остави незапушена или да се използва петриево блюдо, за да се поддържа газовото равновесие.
6. Защо някои клетки се нуждаят от натриев пируват?Колко натриев пируват трябва да добавя към средата?
Пируватът е метаболит на органична киселина в гликолитичния път*, който лесно влиза и излиза от клетката.Следователно добавянето на натриев пируват към средата осигурява както източник на енергия, така и източник на въглерод за анаболизъм, помага за поддържането на определени специфични клетки, помага при клетъчно клониране или е необходимо, когато серумните концентрации в средата са намалени.Натриевият пируват също помага за намаляване на индуцираната от флуоресценцията цитотоксичност.Натриевият пируват обикновено се добавя в крайна концентрация от 1 mM.наличните в търговската мрежа разтвори на натриев пируват обикновено са 100 mM разтвор за съхранение (100X).
Преведено с www.DeepL.com/Translator (безплатна версия).
Време на публикуване: 21 юни 2022 г